Биохимическая характеристика полифенолоксидазы Dimocarpus longan дает представление о ее каталитической эффективности.

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 20322 (2022) Цитировать эту статью

945 Доступов

1 Цитаты

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Плоды тропического лонгана «драконий глаз» богаты питательными веществами и антиоксидантами. Они страдают от ферментативного потемнения после сбора урожая - процесса, за который главным образом отвечает семейство ферментов полифенолоксидазы (PPO). В этом исследовании две кДНК, кодирующие РРО, были клонированы из листьев Dimocarpus longan (Dl), гетерологично экспрессированных в Escherichia coli и очищенных с помощью аффинной хроматографии. Препро-DlPPO1 содержит на своем N-конце два сигнальных пептида, которые облегчают транспортировку белка в строму хлоропласта и в просвет тилакоида. Удаление двух сигнальных пептидов из препро-DlPPO1 дает про-DlPPO1. Препро-DlPPO1 проявлял более высокую термоустойчивость, чем про-DlPPO1 (разворачивался при 65°C по сравнению с 40°C), что позволяет предположить, что сигнальный пептид может стабилизировать складку DlPPO1. DlPPO1 можно классифицировать как тирозиназу, поскольку она принимает как монофенольные, так и дифенольные субстраты. Про-DlPPO1 проявлял наибольшую специфичность по отношению к природному дифенол(-)-эпикатехину (ккат/КМ 800 ± 120 с-1 мМ-1), что выше, чем у 4-метилкатехина (590 ± 99 с-1 мМ-1). 1), пирогаллол (70 ± 9,7 с-1 мМ-1) и кофейная кислота (4,3 ± 0,72 с-1 мМ-1). Кинетическая эффективность препро-DlPPO1 в 23, 36, 1,7 и 4,7 раза ниже соответственно, чем эффективность, наблюдаемая с про-DlPPO1 для четырех вышеупомянутых дифенольных субстратов. Кроме того, исследования докинга показали, что (–)-эпикатехин имеет более низкую энергию связи, чем любой другой исследованный субстрат. Как кинетические, так и in-silico исследования убедительно свидетельствуют о том, что (-)-эпикатехин является хорошим субстратом DlPPO1, и подтверждают сродство PPO к конкретным флавоноидным соединениям.

Полифенолоксидазы (ППО) представляют собой двухмедные металлоферменты типа III, присутствующие в бактериях1, грибах2,3, археях4, растениях5, насекомых6,7 и животных, включая человека8,9. Семейство PPO содержит тирозиназы (TYR)10,11,12,13 и катехолоксидазы (COs)14,15. TYR катализируют орто-гидроксилирование монофенолов в о-дифенолы (монофенолазная активность, КФ 1.14.18.1) и последующее окисление соответствующих о-дифенолов в о-хиноны (дифенолазная активность, КФ 1.10.3.1), тогда как CO могут выполнять только последняя дифенолазная активность13,16. Получающиеся в результате хиноны являются высокореактивными соединениями и быстро полимеризуются неферментативно, образуя тем самым сложные пигменты от желтого до черного, известные как меланины17,18.

In vivo растительные ППО транслируются как белок-предшественник (препро-ПРО), что соответствует трансляции ~ 600 аминокислот с массой примерно 60–75 кДа19,20. Препро-PPO содержит три отдельных домена; N-концевая сигнальная последовательность, каталитически активный домен, который содержит сайт Cu-Cu, и C-концевой домен, экранирующий активный домен5,20,21 (рис. S1). Сигнальная последовательность (около 80–100 аминокислот) направляет белок к его внутриклеточному месту назначения, пока он сам отщепляется22,23. После транслокации через тилакоидную мембрану оставшийся белок-пассажир процессируется до латентной формы (проформы), масса которой обычно составляет 45–69 кДа14. Биядерный медный центр, где каждая медь индивидуально координируется тремя остатками гистидина17,24, расположенными в активном домене, остается экранированным С-концевым доменом, эффективно предотвращая воздействие на активный сайт потенциальных субстратов. Задержка увеличивается, когда С-концевой домен отделяется от активного сайта. In vitro на разрушение могут влиять протеазы (например, трипсин, протеиназа K)25, кислый или основной pH24, жирные кислоты26 и искусственные детергенты (например, додецилсульфат натрия, SDS)17,27,28,29,30,31, 32,33. Хотя естественный протеолитический механизм неизвестен17, недавно сообщалось, что растительные PPO способны к самоактивации, которая может аутопротеолитически отделять активный фермент от C-концевого домена34,35,36.